Effect of six diets during the larval and adult period of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) under laboratory conditions

Tipo y diseño de investigación

Se realizó un estudio prospectivo aplicándose la metodología experimental de investigación, desarrollando la estrategia del diseño en bloques completamente al azar donde los bloques constituyen los ensayos y los tratamientos constituyen las dietas alimenticias. El experimento se llevó a cabo con 50 larvas por bandeja (x 3 repeticiones x 3 ensayos).

Población, muestra y muestreo

La población total estuvo constituida por 2,700 larvas a partir de huevos capturados de especímenes silvestres mediante uso de ovitrampas por seis (06) semanas en la ciudad de Iquitos. Se utilizó la generación F2 para los ensayos del presente estudio de investigación.

Descripción de los procedimientos

Procedimiento de campo: Se realizó la obtención de huevos a partir de ovitrampas, colocadas en las viviendas domiciliarias, elegidas por conveniencia, con una separación promedio de 400 m una de otra con la ayuda de un GPS, de acuerdo con su capacidad de dispersión del vector (Lower, 2017; Nelson, 1986); previa aceptación del jefe de familia a través de una hoja informativa.

Procesamiento de las dietas: Se utilizaron 6 tipos de dietas para la alimentación en la etapa larval, con elevado porcentaje de proteínas, 5 de procedencia comercial y una dieta CIETROP-CC preparada en el laboratorio de entomología con 47 % de proteína bruta. Todas las dietas fueron procesadas en un moledor de café marca BOSCH modelo TSM6A013B, tamizadas con una malla de 250 μm; el alimento de las larvas se ha diluido en agua destilada para facilitar la adición del alimento por ser una mínima cantidad. Se detalla la composición nutricional de cada dieta en la Tabla 1.

Los sustratos de papel con los huevos de Ae. aegypti pasaron a ser secados por 3 días, para completar su desarrollo embrionario y obtener una población equitativa en edad y desarrollo (Benedict et al., 2020; Sasmita et al., 2019; Wohl & McMeniman, 2023). El día de la eclosión, día 1 las larvas fueron alimentadas con 0,20 ml de dieta. El día 2 recibieron 0,30 ml de dieta. El día 3 se administró 0,40 ml de dieta. El día 4 se alimentó con 0,50 ml de dieta. El día 5, 60 ml de dieta y cada día después del inicio de la pupación las larvas recibieron 0,30 ml de dieta, para evitar la sobrealimentación y que se ensuciara el agua (van Schoor et al., 2020). Las larvas se alimentaron todos los días a las 08:30 horas.

Preparación de la dieta CIETROP-CC

el alimento fue elaborado con base en la fórmula del Cuadrado de Pearson que es una de las formulaciones utilizadas para elaborar dietas alimenticias para peces en la Amazonía Peruana (Aguilar-Ramírez, 2014; Guerra Flores, 2006) (Figura 1).

La preparación consistió primero en conocer la composición de proteína bruta de cada insumo a utilizar en la dieta. Posteriormente cada insumo fue agrupado en fuentes proteicas (insumos con contenidos proteicos brutos mayores a 20 %) y fuentes energéticas (insumos con contenidos proteicos menores al 20%). Una vez agrupado los insumos, se procedió a calcular el promedio proteico de cada grupo. Conociendo esto, se iniciaron los cálculos para preparar un alimento ± 47 % de proteína bruta (Tabla 2).

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Figura 1.

Cuadrado de Pearson para preparar una dieta alimenticia. 1A. Promedio del % fuente proteica y fuente energética, cálculo del requerimiento proteico y energético. 1B. cálculo del % de fuente proteica y fuente energética para preparar alimento al 47% de proteína. Y 1C. % requerido de las dos fuentes.

Desarrollo larvario de Ae. aegypti

Las larvas se criaron siguiendo el modelo de (Nasci & Mitchell, 1994). Después de 12 horas de haber eclosionado, fueron transferidas en número de 50 a los contenedores de 11,5 x 6 cm con 300 ml de agua declorada; el nivel del agua se comprobó diariamente y se añadió el agua necesaria para mantener el volumen de inicio. La temperatura del ambiente osciló en 27,33 ± 2 °C humedad relativa (HR) 77,15 ± 7 y fotoperiodo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad; condiciones ambientales óptimas que se requieren para un insectario de crianza de mosquitos Aedes. Una vez inició la pupación, las larvas fueron retiradas en forma diaria.

Supervivencia larvaria

se observó diariamente el tiempo que transcurre desde la eclosión de los huevos hasta la pupación de las larvas; pasando por los estadios de larva I hasta larva IV. Con la finalidad registrar los datos demográficos, se contó diariamente para cada bandeja el número de larvas que alcanzaron la pupación.

Emergencia de pupas

los recuentos de pupas se realizaron diariamente para determinar el tiempo medio de pupación. Las pupas fueron recolectadas con una pipeta plástica rotulada por tipo de dieta y transferidos a vasos plásticos de 0,3 onzas con 100 ml de agua declorada; posteriormente se colocaron en vasos de 1 L, cubiertos en la parte superior con mallas de tul y presionados con ligas, hasta la emergencia del adulto. Se controlaron los datos de: fecha de pupación, número de pupas por dieta y mortalidad.

Longitud alar

después de 24 h de la emergencia de adultos, estos fueron muertos por congelación a -20 °C por 30 minutos y se almacenaron en placas Petri. El tamaño corporal de los mosquitos adultos se representó mediante la medición de la longitud de las alas; una única ala fue removida y fijada con cinta adhesiva transparente en una lámina portaobjeto. Usando un ocular micrométrico se midió el tamaño del ala de hembras y machos, desde la incisión axilar hasta la extremidad del ala, vena R4+5 excluyendo las cerdas del borde (Kittayapong et al., 1992; Nasci & Mitchell, 1994). La longitud de las alas se midió utilizando un estereomicroscopio SZX16 Olympus.

Aspectos biológicos evaluados

se evaluó la emergencia de las pupas y el tiempo de duración del ciclo de la larva; en la etapa de pupas se tomaron los datos de cantidad de pupas por día. Así como la medición del tiempo transcurrido desde la eclosión de los huevos hasta la emergencia del mosquito adulto.

Análisis de datos

Se realizó el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier y la comparación de longitud de las alas por cada dieta mediante la prueba de la Mediana de Mood. Todos los procedimientos fueron realizados usando el software STATA versión 14,0. Las diferencias fueron consideradas significativas teniendo en cuenta un P < 0,05 para todos los análisis.

Consideraciones éticas

El estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Ética para el Uso de Animales en Investigación del Instituto Nacional de Salud Peruano, mediante RD N° 441-2017-OGITT-OPE/INS.

Efecto de las dietas en la sobrevida larvaria del Ae. aegypti

El promedio de días entre el paso de larva-I a larva-IV fue similar entre las 6 dietas alimenticias 5 a 13 días (Figura 2), pupas de 2 a 5 días y adultos de 2 a 4,5 días. La dieta de levadura de cerveza tuvo menor sobrevida y mayor tiempo de desarrollo en larvas, pupas y adultos. El número inicial de larvas por dieta alimenticia fue de 450, donde las larvas alimentadas con levadura presentaron menor tasa de supervivencia de 406 larvas (88%) con respecto al resto de las dietas que mostraron una supervivencia superior con 449 larvas (99 %). La proporción de hembras y machos adultos emergidos fue similar en todos los tratamientos, observándose una relación cerca 1:1 entre los machos y hembras (Tabla 3).

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Figura 2.

Supervivencia de larvas de Ae. aegypti alimentados con seis tipos de dietas.

Influencia de las dietas en el tamaño adulto del mosquito Ae. aegypti

Se midió el tamaño alar de 2,567 ejemplares adultos de Ae. aegypti, de los cuales 1,263 fueron hembras y 1.304 ejemplares machos. Durante el proceso de separación de alas de los mosquitos, se deterioraron 71 ejemplares (Tabla 4 y Figura 3).

Existen diferencias significativas en las medianas de las longitudes de las alas del mosquito Ae. aegypti con respecto al sexo (p = 0,000), siendo las de las hembras (Mediana de 2,88) superiores a las de los machos (Mediana de 2,23). Con relación al efecto de las dietas alimenticias (p = 0,000); la dieta Peces 2-NF tiene una longitud alar superior en el percentil 50 (Mediana de 2,93) y se extiende aproximadamente entre 2,92 hasta 2,95, siendo estadísticamente igual a la dieta alimenticia Gato-SC (Mediana de 2,91); en contraste con la dieta Peces 1-AO la cual presenta una Mediana de 2,81.

Los mosquitos se midieron desde la incisión axilar hasta la extremidad del ala, vena R4+5 excluyendo las cerdas del borde. Las comparaciones de las barras son dentro de cada sexo, ♀ = hembra y ♂ = macho, y no son significativamente diferentes.

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Figura 3.

Tamaño alar de los ejemplares hembra y machos de Aedes aegypti según dieta

En este estudio no se encontraron diferencias significativas en el desarrollo larval ni sobrevida de los mosquitos adultos entre los 6 tipos de dietas alimenticias evaluadas. Se encontró que el mosquito Ae. aegypti tiene una alta tasa de supervivencia en casi todas las dietas alimenticias, con excepción de la dieta Levadura de Cerveza – LV.

Los resultados muestran que el CIETROP-CC es una dieta que presenta un elevado porcentaje de proteínas de fácil preparación, que permite una concentración proporcional frente a dietas comerciales. Contar con una dieta preparada “in house” evita enfrentar retos de adquirir dietas de marcas comerciales como desabastecimiento de dietas, variación de composición nutricional y acceso (Senevirathna et al., 2020).

No todas las dietas alimenticias son óptimas para la crianza de mosquitos, condicionando el mantenimiento de una colonia (Martinson & Strand, 2021; Merritt et al., 1992; Souza et al., 2019; van Schoor et al., 2020), la alimentación en los estadios larvales tiene una gran influencia en la supervivencia, la reproducción (Araújo et al., 2012; Manrique-Saide et al., 1998; Moreno et al., 2014; Nasci & Mitchell, 1994; Pérez Alarcón, 2019; Rivera-Pérez et al., 2017), tamaño del cuerpo del mosquito adulto y resistencia a insecticidas (Grossman et al., 2018; Jensen et al., 2016; Lang et al., 2018), así como la capacidad de transmitir enfermedades (Senevirathna et al., 2020; Takken et al., 2013). El mantenimiento y colonización del Ae. aegypti en condiciones de laboratorio tienen mucha variación, aunque proporcionan una nutrición suficiente para permitir el mantenimiento de las colonias (Benedict et al., 2020; Sasmita et al., 2019).

En este trabajo se evaluaron seis dietas alimenticias, cinco de ellas alternativas comerciales, y una preparada en el laboratorio (CIETROP). A pesar de las diferentes proporciones de proteínas, grasas, fibras y otros; las larvas se adaptan y se desarrollan por igual. En general, todas las dietas mostraron un desarrollo larvario satisfactorio, incluso las larvas alimentadas con LV, dieta que desarrolló rápidamente polución del agua (Rivera-Pérez et al., 2017) con formación de una película de grasa que ocasionó mortalidad en las larvas, aunque la diferencia no fue significativa.

La dieta elaborada en el laboratorio CIETROP se compuso de proteínas y carbohidratos, no se diferenció de otras dietas que aportaban otros componentes. El aporte nutricional busca brindar a las larvas un contenido proteico superior al 20 % ya que los aminoácidos esenciales que conforman la proteína, así como las grasas, azúcares y esteroles han demostrado ser importantes en el desarrollo de los diferentes estadios larvales y el funcionamiento del mosquito adulto (Rivera-Pérez et al., 2017). Formulaciones de dietas elaboradas a base de proteínas de origen animal favorecieron la supervivencia larval y producción de mosquitos adultos en Ae. aegypti (van Schoor et al., 2020) y en Anopheles gambiae Giles, 1902 (Benedict et al., 2020; Shapiro et al., 2016). Se menciona que el efecto de una dieta en el desarrollo larval se debe a la participación de ciertas bacterias en la digestión y descomposición de las dietas que promueven dicho desarrollo y crecimiento (Martinson & Strand, 2021) que no evaluado en este estudio. Igualmente es necesario considerar los recursos alimenticios disponibles para las larvas de mosquitos en sus hábitats naturales y tener clara la relación entre disponibilidad de alimentos, competencia vectorial y aptitud de los mosquitos (Merritt et al., 1992; Souza et al., 2019). La dieta de levadura de cerveza, fue la única que formó una película de grasa en la superficie del agua que incidió en la mortalidad de las larvas aunque sin diferencias significativas (Pérez Alarcón, 2019).

No se evidenciaron diferencias en la envergadura alar, la cual fue similar a lo reportado en un estudio de eficiencia de dietas para establecer una cría en masa de Ae. aegypti en México (Bond et al., 2017) y a diferencia de la investigación llevada a cabo por Senevirathana et al. (2020) cuyos resultados mostraron valores superiores a 5 mm de envergadura alar en un estudio de historia de vida influenciada mediante una dieta larval en Ae. aegypti; dichos valores son sumamente superiores a los resultados obtenidos, lo cual puede deberse a ciertas características genéticas de la población en esa zona (Lainhart et al., 2015). Los resultados obtenidos en esta investigación, con referencia al tamaño alar, se encuentran dentro de los valores reportados en estudios de los hábitats larvales y el tamaño del mosquito adulto (Schneider et al., 2004).

Los resultados encontrados dan a conocer que existen muchas dietas en el mercado local que pueden ser utilizados para la cría del Ae. aegypti e incluso se puede preparar una dieta con ciertos ingredientes locales. No existe una diferencia significativa entre las seis dietas evaluadas, la misma que se evidencia con los resultados del tamaño alar de los mosquitos y el alto porcentaje de supervivencia de estos (Khan et al., 2013; Senevirathna et al., 2020). A pesar de que la dieta CIETROP-CC no fue la mejor dieta de todas; su elaboración permitirá determinar las características nutricionales de la especie. Sin embargo, debido a las limitaciones del diseño se requieren estudios complementarios microbiológicos y químico proximales de las dietas.